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人B淋巴母细胞辐射敏感性的影响研究

人B淋巴母细胞
<人B淋巴母细胞>
摘要:目的 探讨长期低剂量(LDR)Y辐射对人B淋巴母细胞HMy2.CIR(HMy)辐射敏感性的影响及其机制。
方法 实验将HMy细胞分为对照组和长期LDR组,其中长期LDR组选用可
以显著促进细胞增殖的低剂量射线对HMy细胞每周照射3次,每次0.032Gy,连续照射4周,在长期LDR处理结束后分别对部分对照组和长期LDR组细胞进行2Gy照射。以CCK-8[内含WST8,即2-(2-甲氧基4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]法检测细胞增殖和辐射敏感性,流式细胞术检测细胞凋亡率和y-H2AX表达,RT-PCR法检测细胞周期相关基因cyelin、细胞增殖核抗原PCNA,以及亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果长期LDR可以显著提高细胞的增殖率(t=9.607,P<0.01),增加 cyclindl和PCNA基因表达(t=6.869、9.229,P0.01),增加抗凋亡基因bel2表达(t=2.662,P<0.05),降低抑凋亡基因bax的表达(=19.908,P<0.01)。同时,受长期LDR照射的细胞对攻击剂量(2Gy)产生适应性,使得细胞辐射敏感性显著降低(=8.896,P<0.01);与单纯2Gy照射组相比,LDR+2Gy组细胞Y-H2AX表达量(t=10.264,P<0.01)和细胞凋亡率(t=4.762,P<0.01)均显著降低。
结论 长期LDR辐射可通过促进周期相关基因表达从而促进细胞增殖,并通过减少细胞凋亡来降低其辐射敏感性。参考文献《人B淋巴母细胞HMy2.CIR(HMy)辐射敏感性的影响》
电离辐射不仅可以诱导细胞损伤,并可以引起多种远后效应,包括基因不稳定性和致癌作用。随着电离辐射在医学和工业上的广泛应用,低剂量射线照射(LDR)的生物效应及其致癌风险得到关注。大量实验研究证实,单次LDR所诱导的效应主要包括适应性反应、辐射超敏反应以及旁效应等2+1,这些LDR效应并不能简单地根据线性无阈模型从高剂量辐射(HDR)相关数据推导而来5,但在长期LDR照射效应及其分子机制方面的研究并不多,多集中于对人类健康影响等效应方面的研究,如长期接受低剂量辐射的工作人员患口腔疾病的概率较正常人高;放射人员外周血WBC、淋巴细胞微核率及染色体畸变率随放射工龄的增加而升高等,但是相关机制还有待进一步研究。本研究主要探讨长期LDR对人B淋巴母细胞增殖与辐射敏感性的影响,并简要探讨其中的分子机制。
材料与方法
1.细胞培养:HMy2.CIR(HMy)细胞购自中国科学院上海细胞库,是一株永生化但非致瘤性B淋巴母细胞,采用含10%胎牛血清(FBS,美国 Gibco公司)、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素的IMDM培养液(美国 Gibco2公司),在37℃、5%CO2饱和湿度下培养,取对数生长期细胞进行实验。
2.照射条件:采用Cs射线装置
(Gammacell- MDS Nordion公司)进行照射,本实验的低剂量照射的剂量率为0.156Gy/min,2gy照射剂量率为0.78Gy/min。源靶距100cm。选用0.016、0.032、0.08、0.4、1、2、4、8Gyy射线对HMy细胞进行照射,选择合适剂量对HMy细胞进行长期处理。实验分为对照组和长期LDR组,其中对照组不做照射处理,而长期LDR组每周照射3次,连续照射4周。为了解LDR对细胞辐射敏感性的影响,在长期LDR处理结束后,取此两组部分细胞分别施以2Gy的y射线照射。
3.主要试剂:CCK-8检测试剂盒购自日本Dojindo研究所;总RNA提取试剂盒购自美国Omega公司RNA逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司;荧光定量RT-PCR检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司; Annexin V--fiTC细胞凋亡坏死检测试剂盒购自美国BD公司;y-H2AX直标抗体购自美国 Cell Signaling公司
4.CCK-8法检测细胞增殖及辐射敏感性:将处于对数生长期的各处理组细胞以175×g重力加速度离心5min后以RPMI1640培养液重悬,每孔2000个细胞/100μ1接种于96孔板中,每种处理设6个平行样,继续培养5~6d,以新鲜RPMI1640培养液作为本底对照。每天观察细胞生长状况,待未照射组细胞生长至70%~80%密度时进行检测:每孔加入10μlCCk-8试剂,在培养箱中孵育2h,以Infinite M2 Tecan公司)在450nm波长下检测样品的吸光度(A)值,A值越大表示存活细胞数越多,并按照以下公式计算处理后细胞的增殖情况:增殖率(%)=(实验组A45均值/对照组A450均值)×100%。其中,HMy细胞受不同剂量y射线照射后的细胞增殖变化情况及长期LDR处理后细胞增殖及细胞辐射敏感性的变化情况均采用CCK-8法进行检测。
5.Rt-PCR检测基因表达:基因引物序列如下:cyelinDI TATTGCGCTGCTACCGTTGA3,下游引物为5CCAATAGCAGCAAACAATGTGAAA3,增殖细胞核抗原(PCNA)的上游引物为5AGGCACTCAAGGACCTCATCA3',下游引物为5GAGTCCATGCTCTGCAGGTTT3';bcl-2的上游引物为5 GGTCATGTGTGTGGAGAGCG3',下游引物为5 GGTGCCCGTTCAGGTACTCA3'bax的上游引物为5GGGTGGTTGCCCTTTTCTACT3',下游引物为5 CCCGGAGGAAGTCCAGTGTC3'B肌动蛋白的上游引物为5 'CCTGGCACCCAGCACAAT3',下游引物为5 'GGGCCGGACTCGTCATAC3',扩增片段大小分别为90、76、89、111、144bp。提取细胞总RNA并反转录成cDNA后行PCR扩增,PCR反应体系(25μ)如下:2× SuperReal PreMix12.5μm;正向引物(10μmol/L)0.75l;反向引物(10moll)0.75ulDNA模板100ng;50× ROX Reference Dye0.5μl;RNase-free ddH2O补至25μl.采用Mx3000P实时PCR扩增仪进行检测,PCR反应条件设置为:95℃预变性15min,95℃变性10s,60℃退火及延伸30s,40个循环。应用Mx3000P系统分析软件采集分析数据。每个处理组设3个平行,对对照组和长期LDR组细胞进行检测。
6.流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率:取对数生长期的HMy细胞于不同条件处理后48h收集细胞悬液。按美国BD公司 FITC Annexin细胞凋亡坏死检测试剂盒说明书,用预冷PBS洗涤细胞2次,175×g离心5min,用1ml1× binding buffer重悬细胞,取100u1加入检测管中,加入5 ul Annexinv-fitc与5ul碘化丙啶(PI),轻微涡旋细胞后室温避光反应15min,再加人400ul× bindingbuffer Gallios流式细胞仪(美国 Beckman公司)检测各组细胞凋亡情况。细胞凋亡率(%)=早期凋亡率(LR)+晚期凋亡率(UR)。每处理组设3个平行。
7.流式细胞术(FCM)检测y-H2AX表达:于攻击剂量2Gy照射后2h进行y-H2AX检测。按美国Cell Signaling公司y-H2AX检测试剂盒说明书,以395×g离心6min收集细胞,弃上清,加入1ml4%甲醛在37℃条件下固定10min并迅速转移至冰上放置1min;加入9ml预冷的无水甲醇(使甲醇终浓度达90%),涡旋后在冰上孵育30min;用预冷的BSA孵育液洗涤2次,加入100μIBSA孵育液重悬细胞,室温封闭10min,再向细胞悬液中加入400μlBSA孵育液及1y-H2AX直标抗体,混匀后室温避光孵育1h,用BSA孵育液洗涤2次后用500μlPBS重悬细胞,用 Gallios流式细胞仪检测细胞yH2AX表达情况。每个处理组设3个平行。
8.统计学处理:实验数据均以x土表示。采用SPSS17.0软件进行统计学处理,两两比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
细胞培养
细胞培养
结果
1.不同剂量y射线照射对HMy细胞增殖的影响:CCK-8法检测表明,低于0.08Gyy射线单次照射可促进细胞增殖,0.016、0.032及0.08Gy照射细胞增殖率分别提高4.7%、9.3%及5.6%,其中0.032Gy照射后细胞增殖率显著高于对照组(t=27.7,P<0.01)。高于0.08Gy的y射线对HMy细胞则表现出明显的增殖抑制作用,并呈现一定的剂量效应关系,其中0.4、1、2、4及8Gy照射细胞增殖率抑制率分别为4%、14.2%、32.2%、55.7%及65.6%。基于此结果,在下面的实验中以可以显著促进细胞增殖的0.032Gy作为分次长期低剂量照射的剂量。
2.长期LDR照射对细胞增殖和辐射敏感性的影响:HMy细胞经4周LDR处理后,细胞增殖率较对照组提高10%(t=9.607,P<0.01),与单次LDR照射引起的细胞增殖变化相似。另一方面,正常HMy细胞在受到2Gy射线照射后,细胞的增殖率显著下降;而对长期LDR组细胞进行2Gy攻击剂量照射后发现,该组细胞的增殖率显著高于单纯2Gy组(t=8.896,P<0.01),说明长期LDR处理可以降低HMy细胞的辐射敏感性,即产生适应性反应,见表1。
细胞实验
3.长期LDR处理后DNA损伤与细胞凋亡:磷酸化组蛋白y-h2AX是DNA双链断裂(DSBs)的灵敏标志,也是检测细胞辐射敏感性的指标。流式细胞术检测y-H2AX的结果如图1所示。统计表明,长期LDR在促进细胞增殖的同时可引起胞内YH2AX表达量的稍许增高,但与对照组比无显著差异。对于2Gy照射组,25.3%左右的细胞中yH2AX呈现高表达,但当细胞受到长期LDR后再施以2Gy照射,其y-H2AX阳性表达细胞的比例只有12.7%,显著低于2Gy照射组(t=10.264,P<0.01),见表1同时,以流式细胞仪检测了细胞凋亡情况,见图2。结果表明,2Gy照射可使得细胞凋亡率增高到12.6%,而长期LDR组细胞凋亡率与对照组比无显著差异;与DNA损伤结果相一致,长期LDR可降低2Gy照射对细胞的损伤,使LDR+2Gy组细胞凋亡率降至7.2%,显著低于2Gy组(t=4.762,P<0.01),见表1
4.长期LDR引起HMy细胞基因表达的变化:基于LDR可以引起细胞增殖的改变、降低细胞辐射敏感性的现象,检测了与细胞周期及凋亡相关基因表达的变化。RT-PCR检测结果显示,长期LDR处理后,HMy细胞内 eyelinDI1和增殖细胞核抗原PCNA表达量显著升高(t=6.869和9.229,P<0.01)。同时,长期LDR处理的HMy细胞内抗凋亡基因bcl-2表达显著升高(t=2.662,P<0.05),而抑凋亡基因bax表达显著降低(t=19.908,P<0.01)。使得be1-2/bax比率达到1.84,显著高于对照组的bcl-2/bax比率(t=55.130,P<0.01),见表2
细胞实验
讨论
细胞增殖加快和细胞凋亡抵抗增强是细胞发生转化和多数癌细胞的典型特征。本研究结果显示,长期LDR可以促进细胞增殖并诱导细胞辐射敏感性下降。RT-PCR法检测表明,长期LDR处理后细胞内与周期相关基因 cyclinD11、与DNA复制密切相关的增殖细胞核抗原(PCNA)表达均显著提高。细胞增殖主要通过细胞周期各时相中的周期蛋白实现,主要包括细胞周期蛋白( cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)和CDK抑制因子(CKIs)研究证实,在细胞周期蛋白中 CyclinDI1与细胞增殖关系最为密切 CyclinD1是调控细胞周期G1期的关键蛋白, CyclinDI1过表达可使细胞周期G1→S期转换时间缩短,促使细胞越过限速点进入S期,从而促进细胞的增殖。在多数恶性肿瘤中均存在cyclinDI CyclinDI1蛋白高表达,而一些因子也可以通过降低 cyelinDI1基因表达而抑制肿瘤细胞生长。另一方面,PCNA作为真核细胞DNA聚合酶8的推动因子,协调DNA复制过程,是真核生物复制复合体的核心成分,它与细胞DNA合成关系密切,在细胞增殖的启动上起重要作用,其量的变化与DNA合成一致。因此,检测其在细胞中的表达,可作为评价细胞增殖状态的一个良好指标本研究得出结论:长期LDR主要通过促进eyelinDI1及PCNA基因表达而发挥促进细胞增殖的作用。
作者:叶爽 袁德晓 谢月霞 潘燕 邵春林

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