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人胃癌细胞系HGC一27细胞特性研究

  人胃癌细胞系
<人胃癌细胞系>
  肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在极少量肿瘤细胞 ,具有自我更新能力和分化潜能 ,是肿瘤增殖生长、转移和复发的根源 ,肿瘤干细胞已成为肿瘤研究的热点 。但是由于缺乏特异的表面标记 ,肿瘤干细胞 的分离纯化一直是各 国科学家亟待解决 的难题之一。2001年 ,BrianSorrentino等认为 ABcG2是一 个“通用的”干细胞标记 J,ABCG2高表达的细胞可高效外排 DNA荧光染料 Hoechst33342,从而能通过流式分选系统分选出相关的SP细胞 ,在某些恶性肿瘤中,sP细胞具有肿瘤干细胞的特性 ,如人脑瘤、乳腺癌等肿瘤干细胞的研究就 是采用了这种方法引。胃癌是全世界第二大恶性肿瘤,越来越多的证据表明肿瘤起源于肿瘤干细胞 (CSC)。目前关于胃癌干细胞的研究 尚处于探索 阶段 ,我们用流式细胞仪进行研究 ,并分析了胃癌细胞系中HGC-27细胞相关的 SP亚群 ,成功分选 出 SP细胞 ,并从增殖能力方面证实其生长能力较一般细胞强 。
1 材料与方法
1.1 细胞株 、仪器和试剂 HGC-27(人胃癌细胞购买(未分化) (中国科学院上海细胞库),RPMI.1640培养粉(Gibco),特级胎牛血清(杭州 四季青生物工程材料有限公 司 ),EDTA-2Na、胰蛋 白酶 (武汉 博 士德 公司)。仪 器 :FACSAria流 式 细 胞 仪 (美 国 BectonDickinson公司),DMIRB荧光倒置显微镜 (Leica公司 )。
1.2 细胞培养人 胃癌细胞株 HGC-27细胞 用含100mL/L胎 牛血清、100ku/L青霉素 和 100ku/L
链霉素的低糖 RPMI一1640培养液,在 37cC、饱 和湿度 、含 50mL/LCO 条件下培养。2.5g/L的胰蛋白酶消化、传代。实验选用对数生长期细胞 。
1.3 细胞染色和 SP分析 EDTA.2Na和胰蛋白酶混合液消化人 胃癌细胞株 HGC-27细胞 ,制备单细
胞悬液 ,离心。用含 5%胎牛血清的 RPMI.1640培养液重悬成 1×10。 ml的细胞悬液 。实验组加入 Hoechst33342至终浓度为 5mg/L,对照组同时加入维拉帕米至终浓度 50mg/L。37oC水浴 90rain,每 l5分钟混匀 1次 ,离心 ,弃去上清 ,用含 5%胎牛血清的磷酸缓 冲液 (PBS)洗一次 ,重悬于冰冷的含5%胎牛血清的 PBS中,加入 PI至终浓度为 2mg/L。上流式细胞 仪分析 SP亚群 。Hoechst33342的激发光为 407nm 紫光。450/40带 通收集 蓝光 ,695/40带通和 655长通收集红光。PI的激 发光为 488nm蓝光 ,用 575/26带通收集红光 。
1.4 流式细胞仪分选 sP 选用对数生长期细胞 ,数量约 2×10 个 ,实验前 1天换液 1次 ,弃去 旧培养液 ,PBS洗 1次 ,加人 EDTA-2Na和胰蛋 白酶混合消化液 1ml,镜下观察细胞变圆,加人含血清培养基中止消化 ,吸管反复吹吸数次 ,脱壁形成细胞悬液 ,移人 无 菌 离 心 管 ,计 数 ,室 温 1000 r/min离 心5min,用含 5%胎牛血清 的 RPMI.1640培养液 重悬成细胞悬液 。严格 细胞计数 。取其 中 2×10。个 细胞分为 两组流式 细胞仪 鉴定 sP细胞 比例 :A组 :
Hoechst33342至终浓度 5ms/L;B组 :Hoechst33342至终浓度 5mg/L+维拉 帕米 至终 浓度 50mg/L。37℃水浴 90min,每 15分钟混匀 1次,冰浴冷却,4℃离心,弃上清,用含 5%胎牛血清的 PBS洗1次,重悬于冰冷的含 5%胎牛血清 的 PBS中,两组分别加入 PI至终浓度 2mg/L,细胞过滤 网过滤制成单细胞悬液后 ,立 即流式细胞仪分析。另外鉴定 剩下的大部分细胞行流式细胞仪分选 ,相 同方法处 理细胞 ,细胞染色 Hoechst33342比例为 l0 个细胞终浓度5mg/L,待鉴定 sP比例稳定成功后立即进行分选,分选出的 SP和 NSP细胞用无菌 10mL离心管(内放 3mL无血清培养液)接取。注意无菌操作 。
1.5 分选后 sP细胞和 NSP细胞行细胞生长 曲线和克隆形成实验 (1)MTr法检测肿瘤干细胞增殖活性 :将无血清培养的细胞按 1×10 爪/孔接种于96孔板 ,同时以不加细胞的培养基调零 。置于培养箱内分别培养 0,1,2,3,4,5,6,7d,结束前 4h每孔加入 MTI"10IxL,继续培养 4h,用二 甲基亚砜振荡溶解蓝紫色结晶 ,全 自动荧光酶标仪在 490nm波长下测定吸光度值 ,取均值并绘制生长 曲线 。(2)克隆形成实验对 比SP和 NSP细胞增值能力 。SP和非SP细胞计数 ,有 限稀释法各取 6O个细胞接种于六孔板培养皿 ,完全培养基培养至 1周 时出现 肉眼可见克隆 ,分别于 8、16d时,弃培养液 ,PBS洗 2次 ,纯甲醇 固定 15min,弃 固定 液,自然 晾 干,加 入Gimsa应用液染色 10min,流水缓慢洗去染液 ,计数克隆数 。克 隆形 成 率 (%)=克 隆数/接 种 细 胞 数 ×100%
1.6 统计学方法 应用 SAS8.0(美 国)软件 ,利用检验方法对结果进行分析 ,每次结果独立重 复三次实验 。数据结果用 ±s。
2 结 果
2.1 SP细胞分析 通过 Hoechest33342蓝光和红光双参图 ,SP细胞亚群位于左下角两种荧光均阴性
或很弱的区域 ,经多次检测 ,人 胃癌细胞株 HGC-27细胞中 SP比例约为 (6.004-0.05)%左右 ,经维拉帕米阻断后 SP细胞 比例均减少为(0.014-0.00)%左右 ,加入维拉帕米后 sP细胞亚群 比例明显减少 ,证实 胃癌细胞系 BGC一823中确实存在 SP细胞。
2.2 流式细胞仪分选 经流式细胞仪分选 出 SP细胞数量为 7.5×10 个 ,NSP细胞为 8.5×10 个。
2.3 SP和 NSP细胞增殖能力结果 比较 (1)SP和NSP细胞生长曲线吸光度值标准差差异有统计学意
义 ,sP细胞生长增值速度较 NSP细胞快。(2)克隆形成增殖能力 比较 :① 克隆形态特征 :sP克隆体积大 ,边界平滑 ,细胞呈巢状隆起生长,结构致密,细胞体积小 ;NSP克隆体积小 ,边界不规则 ,细胞体积大;
②细胞克隆形成能力 :SP型细胞克隆集落传代后细胞分裂增殖旺盛 ,可以连续传代 20代 以上 ,而且传代的早晚对其克隆形成无明显影响。NSP型细胞克隆集落传代 后细胞分裂增殖较旺盛 ,l周后虽然也能形成次代克隆集落 ,但大部分孔中的单个细胞不分裂或分裂成 2个细胞后 ,其边缘逐渐变得毛糙 ,并渐渐伸出毛刺状的小突起 。
3 讨论
  荧光染料 Hoechest33342是一种脂溶性 DNA结合染料 ,可 以穿过细胞膜与 DNA结合 ,某些癌细胞
和干细胞可以将 Hoechest33342排 出细胞 ,表现为细胞核不着色或者很低程度的着 色 ,利用流式 细胞仪可以将这些不着色 细胞加 以分离 ,人们将利用该特性分离的这部分细胞称为 sP细胞¨ ,SP细胞能向不 同类型和不同胚层的组织细胞分化 ,在骨髓、骨骼肌及 神 经 组 织 均 发 现 了 SP细 胞。Setoguchi等发现很 多肿 瘤细胞 系 中都存 在-d'群 SP细胞 ,并证实 SP细胞中可能富含肿瘤干细胞。
  本研究探讨了人 胃癌细胞 系 HGC一27细胞 中相关的 SP细胞亚群存在 的可能 ,发现相关的 SP亚群占 HGC-27细胞 的 6.00%左右 ,维拉帕米阻断后减少为 0.01%左右 ,有统计学 意义 ,可通过流式 细胞仪分选出其中的 SP细胞亚群。但要证明 SP细胞就是干细胞还需寻找 sP细胞细胞表面特有的干细胞标志物 ,目前大多数研究主要使用 CD133、CD44、CD24等作为 胃癌干细胞表 面标志物 ,此外有研究者近日提出 Lgr5+ve可作为远端 胃干 细胞 的标志物。由于国内外 尚无成功分选鉴定明确的胃癌干细胞表面标志物作为参照物 ,所以难以准确检测出SP细胞表面特异干细胞标志物 ,这也是我们下一步研究的重点和难点。胃癌肿瘤干细胞 的研究 _1为 胃癌的治疗 提供了新的治疗方 向,倘若证实 胃癌 中相关的 SP细胞 中确实富含肿瘤干细胞并能找到特异表面标志物进行标记 ,我们就能进一步寻找 胃癌发生发展的根源并采取定性 、定量 的靶 向治疗方案 ,从根本上控制胃癌的发生和发展 。