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抵制乳腺癌细胞增殖、迁移侵袭的研究实验

细胞培养
<细胞培养>
原标题:微小RNA-194对基底样乳腺癌细胞HCC1937增殖、迁移侵袭及上皮-间充质转化的影响
作者:孔吉霖,吕志栋,姜丹丹.
  基底细胞样乳腺癌组织学分级较高、恶性程度高、进展迅速、复发转移率高,预后差,较其他分子分型的乳腺癌,除手术治疗、化疗及放疗外,缺少内分泌治疗和针对人类表皮生长因子受体-2(Her-2)的分子靶向治疗等措施。研究表明,微小RNA-194(miR-194)可通过多种机制抑制肿瘤细胞增殖、迁移侵袭能力231,发挥抑癌基因作用。我们设计用慢病毒为载体将miR-194感染基底细胞样乳腺癌细胞株HCC1937,观察其对HCC1937细胞增殖、迁移侵袭能力以及上皮间充质转化(EMT)的影响。
材料与方法
1.材料:人基底细胞样乳腺癌细胞株HCC1937人乳腺正常上皮细胞H578Bs购自青岛大学附属医院中心实验室;RPM1640培养液购自 HyClone公司胎牛血清购自 Gibco Trizol购自美国 Invitrogen公司;实时定量反转录聚合酶链反应(rt-pcr)试剂盒(SYBR PrimeScript miRNA RT-pcrKit)购自 TaKaRa公司;细胞计数试剂盒(CCK-8)购自广州奕源生物有限公司;过表达has-mi-194慢病毒及慢病毒阴性对照购自上海吉凯基因化学技术有限公司;兔抗人N钙黏蛋白(n-cadherin-)、E-钙黏蛋白(E-cadherin -actin)单克降抗体均购自 Abcom公司,二抗购自北京康为世纪生物技术有限公司 Western blot所用增强化学发光(ECL)试剂盒及聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自 Millipore公司;
2.细胞培养:培养基底样乳腺癌细胞株HCC1937及人正常乳腺细胞株Hs578Bst细胞于含10%胎牛血清的RPM11640培养基中,将细胞置于37℃,5%CO2湿度适宜的培养箱培养。待细胞处于对数生长期,并且融合率达90%时传代,继续培养;
3.慢病毒感染及实验分组:以3×103个HCC1937细胞接种于含2ml含10%胎牛血清RPMI1640培养基的6孔板中,37℃、5%CO2、湿度适宜的培养箱中培养过夜,待细胞贴壁生长达20%-30%后加人l-has-mir-194慢病毒及阴性对照病毒CON157,携带增强绿色荧光蛋白(EGFP),混匀后继续培养,8-12h后观察细胞状态,并更换为新鲜培养基,48-72h后于荧光倒置显微镜观察EGFP表达。L-has-mi-194慢病毒感染HCC1937细胞作为实验组,阴性对照病毒CON157感染HCC1937细胞作为阴性对照组,未经处理HCC1937细胞为空白对照组Hsa-mi-194序列为5-CCAGUGGGGCUGCUGUUAUCUG-3 '。
4.rtqpcr检测mir-194表达:传统 Triznl法提取H578Bst及各组HCC1937细胞中总RNA,按照t-qpCR试剂盒说明书,以多聚腺苷酸(poly)加尾法对总RNA进行反转录,将获得的DNA取样于实时荧光定量PCR仪( Roche LighCycter Real--timePCR扩增仪)进行PCR,反应体系25,每个标本设3个复孔,反应条件为:95℃30s预变性,95℃5s60℃30,40个循环,进行扩增反应,以2-计算各组细胞中miR-194表达本实验选择6作为内参引物序列:mir-194上游引物:5-GCGCCGGTCTAA- CAGCAACTCC--CTCCCTTCG- CCAGCACA-AACGCTTCACGAATTT- GCGT-3;
5.cck-8检测mi-194对乳腺福HCC1937细胞增殖的影响:将各组细胞以100μ孔接种于96孔板中,每孔为5×103个细胞将培养板在37℃5%CO2、湿度适宜的培养箱中分别培养12、24、48、72h,向每孔加10CCK-8溶液,于37℃培养箱中孵育2h,测定每孔在450nm处吸光度(A)值;
6. Transwell小检测miR-194对HCC1937细胞迁移及侵袭能力的影响:将各组细胞于无血清培养基中饥饿培养12h后,以2.5×10个浓度接种于8um孔径的 Transwell小室上室(检测侵袭能力的小室,上室面平铺60μ稀释后的 Matrigel Matrigel无血清培养基=1:8),小室内细胞以200μ无血清RPMI1640培养,下室内为500含20%胎牛血清的RPM1640培养基,将培养板在37℃、5%CO2、湿度适宜的培养箱中培养24h,对小室下室面细胞进行结晶紫染色,并拍照计数。
7. Western blot -cadherin N-cadherinf-蛋白表达:用RIPA缓冲液和苯甲基磺酰氟(PMSF)混合液提取处于对数生长期的各组细胞总蛋白,各取10μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAge),然后转移印记蛋白到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2h。4℃孵育一抗过夜,室温孵育二抗1h。ECL发光试剂显色,置于凝胶成像仪中成像以条带灰度值计算目的蛋白相对含量。
8.统计学方法:结果均以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS19.0统计软件分析,多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-检验,以P<0.05为差异有统计学意义;
1.表示miR-194相对表达量。以人正常乳腺细胞Hs578Bst细胞作为对照细胞,miR-194在HCC1937中相对表达量为0.000493±0.050000,明显低于人正常乳腺细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。经慢病毒感染后的HCC1937细胞中,实验组miR-194的表达量为432.93±0.01,明显高于阴性对照组(0.90±0.02)及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.感染miR-194后HCC1937细胞增殖能力变化:分别于12、24、48、72h检测各组细胞在450nm处紫外线吸光度值,并绘制生长曲线(图1),实验组细胞的增殖明显受到抑制,差异有统计学意义(P<0.01)。72h差异最为显著,各组细胞的增殖率分别为:空白对照组细胞增殖率为(100±0)%、阴性对照组细胞增殖率为(104.29±0.13)%、实验组细胞增殖率为(44.81±0.11)%
3.感染miR-194后HCC1937细胞迁移与侵袭能力变化:迁移实验中,下室面细胞数分别为实验组:
(47.00±2.35)个;阴性对照组:(94.00±4.53)个;空白对照组:(89.00±5.67)个。侵袭实验中,下室面细胞数分别为实验组:(31.00±1.64)个;阴性对照组:(65.00±6.39)个;空白对照组(72.00±2.48)个。实验组细胞在迁移与侵袭模型的小室中,穿过小室到达下室面的细胞数均明显低于阴性对照组及空白对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.05);
4.感染mi-194后hCc1937细胞e- -cadherinN- -cadherin蛋白表达:实验组、阴性对照组及空白对照组细胞间E- -cadherin蛋白相对表达量(实验组:0.175±0.053、阴性对照组:0.516±0.032、空白对照组:0.433±0.047)不同,差异有统计学意义(P<0.05);两对照组间比较,E- -cadherin蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05);与两对照组分别比较,实验组E- -cadherin蛋白表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。3组乳腺癌细胞间N -cadherin-蛋白相对表达量(实验组:0.342±0.012、阴性对照组:0.137±0.007、空白对照组:0.142±0.021)不同,差异有统计学意义(P<0.01);两对照组间N- -cadherin蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05);与对照组分别比较,实验组N- -cadherin蛋白相对表达量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01,图2)。
细胞实验
讨论
  基底细胞样乳腺癌细胞雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、Her-2表达均为阴性,具有增殖活性高、迁移侵袭能力强、复发转移率高及预后不良等特点。miR-194是一种内源性非编码的小分子RNA,能与靶基因mRNA3端非编码区域完全或不完全互补结合,诱导降解或抑制靶基因mRNA翻译,影响蛋白水平的表达,通过调控细胞周期、影响细胞增生、迁移侵袭、诱导EMT等在多种肿瘤中发挥抑癌作用。本研究结果显示HCC1937乳腺癌细胞中miR-194表达量明显低于正常乳腺上皮细胞,表明miR-194在乳腺癌细胞中表达缺失,可能与基底细胞样乳腺癌细胞增殖活性高有关。将慢病毒作为载体将miR-194感染HCC1937细胞,我们发现实验组细胞中miR-194高表达显著,其细胞增殖能力明显下降,表明miR-194在人基底细胞样乳腺癌中可发挥抑癌基因的作用。
  EMT是细胞转化成具有间质特性的过程,在这一过程中上皮细胞失去极性及细胞间紧密连接从而获得移行和游走的能力E- -eadherin是EMT标志蛋白之
一,是实现细胞间黏附连接、维持上皮细胞特性的重要分子,其减少或丢失使细胞失去细胞极性及细胞间连接;而间质标志蛋白N- cadherinVimentin)等在EMT中表达上调,增加细胞运动,提高上皮细胞来源的恶性肿瘤迁移和侵袭能力Li等和Meng等发现miR-194能够体外抑制胃癌及肝癌细胞的迁移和侵袭力,且通过干扰EMT,进一步抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。本研究结果显示,miR-194能显著降低乳腺癌细胞E -cadherin- -cadherin蛋白表达,进而发挥其抑制乳腺癌细胞发生EMT、抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭的作用。
  本研究结果表明,转染miR-194后基底细胞样乳腺癌细胞株HCC1937的增殖、迁移侵袭的能力显著受抑,并干扰其EMT相关蛋白表达。应用miR-194治疗基底细胞样乳腺癌,以及对内分泌治疗、分子靶向治疗耐药的其他分子分型乳腺癌尚有待进一步研究。
作者:孔吉霖,吕志栋,姜丹丹.