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上海细胞库(大鼠肝上皮样干细胞)生物作用

  大鼠肝上皮样干细胞
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  诱导WB-F344大鼠来源的肝上皮样干细胞(WB)产生表达PDX1阳性的胰腺内分泌前体细胞,为将来干细胞治疗糖尿病提供充足的细胞来源。
  糖尿病是严重危害人类健康的慢性疾病,呈逐年上升趋势,胰岛移植及相关细胞代替治疗是一种可能根治的方法,但供体细胞来源的缺乏在一定程度上限制其广泛应用于临床在胰腺发育过程中,胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox factor1,Pdx1)对早期胰腺分化以及胰腺内分泌细胞分化和功能的成熟起关键作用在胚胎发育过程中,肝脏和腹胰由相同细胞群分化而来在同内胚层,无论这些细胞分化为肝脏或胰腺组织,是由他们的位置决定或局部生长因子还是细胞粘附分子的表达决定。可能上皮细胞群内,胰腺和肝脏有着共同的干细胞群。已证据表明胰腺干细胞能分化为肝细胞的能力。
  同样,也有证据表明肝细胞通过转入PDX1,能产生胰岛素产生的细胞。近来已有研究利用小分子化合物成功诱导多能干细胞定向分化,如5氮杂胞苷(5-aza-2-deoxycytidine5-AZA),DNA甲基化化酶抑制剂,成功诱导人胰腺导管细胞PANC-1表达NGN3,向内分泌细胞分化曲古抑菌素A(Trichostatin TSA)调节染色质重塑,促进胰腺内分泌细胞分化的进程。维甲酸(Retinoic acid RA)有利于促进胰腺内分泌前体细胞的发育本研究目的在于利用5-aza,tsa,raITS等小分子化合物,诱导WB-F344大鼠来源的肝上皮样干细胞(WB)产生表达PDX1阳性的胰腺内分泌前体细胞,为将来干细胞治疗糖尿病提供充足的细胞来源。
1材料和方法
1.1细胞系
wB-F344大鼠来源的肝上皮样干细胞(WB)1617,由军事医学科学院基础研究所提供。为第3代子细胞大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)由301医院内分泌科研究所提供。
1.2实验动物
SD乳鼠(出生1天),SD大鼠(8-10周),由301医院动物中心提供,大鼠实验遵照301医院实验动物管理及使用的相关规定严格执行。
1.3主要试剂
  高糖DMM、低糖DMEM、RPMI1640、 KNOWN-outd-MEM、B-27、N-2、L-谷氨酸;ITS、TSA、非必需氨基酸均购自(Gibco,美国),胎牛血清(FBS,PAA,德国);巯基乙醇;5-AZA、胰蛋白酶、 Hoechst-33342核染料、全反式维甲酸(Retinoic-sigma,美国);eGF、b-fgfPeprotech,美国);乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(北京化学试剂公司,中国);PDX1一抗山羊抗大鼠、二抗为驴抗山羊TRITCSanta Cruz,美国),TRI ReagentFermentas,加拿大),rt-PCR试剂盒(Promega QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen,
德国)。
1.4仪器设备
  超净水制备机,超净工作台:北京四达净化技术研究所制造;CO2细胞培养箱:( Heraeus BB116/B5060,德国);普通光学显微镜、荧光显微镜、倒置相差显微镜OLYMPUS,日本)电泳仪(北京市六一仪器厂DYY-8C型,中国);电泳凝胶成像系统:(Bio-bad,德国);PCr仪(GeneAmp PCR System9700,德国);
16.1显微镜观察观察诱导细胞形态改变
  1.6.2rt-pcr及实时定量PCR检测 TRIzol裂解细胞,进行WB,5-AZA诱导分化完成第二步后的WB-A细胞、SD大鼠乳肝及SD成年鼠胰腺组织等总RNA的提取,具体步骤参照TRIzol Fermentas公司试剂盒说明去除DNA污染,紫外分光光度计测定终样品OD260/280确定RNA含量,反转录获得cDNA,反转录具体步骤参照反转录试剂盒,接着进行PCR扩增,95℃预变性5min,30个循环,具体引物序列及退火温度见附表1,循环结束时72℃延伸10min,取8μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像保存图像。实时定量PCR检测使用QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen),具体步骤按试剂盒说明,每个样本设置3个复孔,95℃预变性5min,40个循环,循环结束时72℃延伸10minDNA含量分析使用AG-9600荧光定量PCR仪(Bitronic)
大鼠肝上皮样干细胞实验

1.6.3PDX1基因测序PCR产物经1琼脂凝胶电泳分离DNA片段,切下含DNA条带的琼脂糖凝胶块是它尽可能小放入1.5mL的离心管中,基因片段胶回收,具体步骤参照天根DNA胶回收试剂盒,得到纯化基因片段,取10μL胶回收产物,PDX1上下游各1μL直接送美吉公司基因测序。
1.6.4PDX1免疫荧光染色六孔板培养的WB-A细胞,WB细胞iNS-1细胞,倒掉培养液,快速PBS洗3次,立即加入4%多聚甲醛固定15min;PBS漂洗除去残余的固定液,0.5%tri-tion X--100作用20min,PBS漂洗后加牛血清封闭30min滤纸吸净封闭液后加入PDX1一抗羊抗(1:100),4℃过夜。PBS漂洗,二抗 TRITC标记的驴抗山羊,室温避光孵育2小时。pBS避光漂洗, Hoechst333342复染核(1:3000,PBS稀释)室温放置10分钟,PBS漂洗3次后,50%丙三醇封片,荧光显微镜下观察。
1.7统计学处理
本实验组间数据比较采用方差分析,以P<0.05,或P<0.01为有统计学意义。
2结果
2.1WB细胞来源的胰腺内分泌前体细胞B-A显微镜观察观察5-AZA诱导2d,TSA1d时WB细胞约10%细胞出现触角,类似神经细胞改变,并核浆比例增大,RA联合ITS诱导7d,我们从图1b中可以看到约有50%细胞出现触角样改变,未出现细胞聚集成簇,仍是单个细胞克隆生长,并且细胞继续增殖。可以传代继续培养。当5-AZA浓度大于5uM时,出现细胞大量死亡,这里没显示具体数据。

2.2WB来源的胰腺前体细胞WB-A细胞的检测
2.2.1实时定量PCR检测WB-A细胞PDX1的表达及基因测序从图2.a中通过实时定量PCR可以看到,WB来源的wB-a细胞表达PDX1,并随5-AZA1um,2um,3um,4um,5uM浓度的增加,PDX1的表达逐渐增强,当浓度再增加到10uM5-AzA时,PDX1表达程下调趋势,得出5um5-AZA为最适合诱导分化条件。为更进一步确定两步法诱导表达的为PDX1基因,我们对其进行基因测序,测序结果明确,诱导获得的WB-A细胞表达PDX1。
2.2.2Rt-PCR及实时定量PCR检测WB-A相关基因的表达通过两步法诱导分化产生的wB-A细胞,表达PDX1、in-sulinl Neurod、 Nestin、NGN3(图2b)在WB表达肝干细胞相关基因如AFP、ALB(图2c,d),而在WB-A细胞中表达大量下调,标志分化的基因C/EBP表达明显下调,而nEstin仍然表达(图2c,d)。

2.2.3免疫荧光检测PDX1表达免疫荧光显示未诱导分化的WB细胞没有细胞核内表达的PDX1的红色荧光,诱导分化后的WB-A细胞约有5%PDX1阳性的细胞。阳性对照组IS-1细胞PDX1表达率近100%
3讨论
  由以上实验结果可知,经过诱导后,细胞发生明显的形态变化,由多边型向神经样触角细胞,但并未形成胰岛样细胞团。诱导后细胞经过实时定量PCR,确定5uM的5-AZA是最合适浓度,基因测序及免疫荧光测定,明确诱导后的WB-A细胞表达PDX1,同时表达胰腺内分泌前提细胞相关基因,NKX2.2、Neurod insulin及 Nestin。WB细胞表达的AFP、ALB、C/EBP等基因表达水平大量下调。Pdx1属于同源盒基因家族成员之一,是主控胰腺细胞群发育并维持成体胰岛正常分泌功能的重要基因,也是公认的胰腺干细胞特异性标志基因。在个体的早期发育过程中,Pdx1蛋白对胰腺的形成具有重要作用,它通过激活与胰腺的形成有关的基因调控胰腺发育,无论是小鼠还是人类,如果Pdxl基因在胚胎发育早期不表达,将导致无胰畸形。在个体生活过程中,Pl是调控胰岛素基因转录、胰岛素颗粒成熟和分泌的重要转录因子。在肝脏与胰腺之间,最有可能的产生编码差异的转录因子就是PDX1基因,肝细胞具有某些组织干细胞功能特征,在一定条件下具有很强的增生更新能力,而且Pdxl细胞转染实验也发现,肝细胞是比较理想的诱导转分化形成胰岛素分泌细胞的靶细胞。
  目前,对干细胞定向诱导分化为胰腺分泌细胞一般可选择三种诱导策略:(1)基因工程改造细胞;(2)改变细胞生存的微环境;(3)转基因方法和体外诱导结合4。在本实验中,我们采用了第2种策略,通过添加一些对细胞生长或者分化的细胞有作用的细胞因子,营养物质,或者化学物质等进行诱导。5-AZA和TSA在WB细胞分化过程中起重要作用。
5-AZA特异的DNA甲基化转移酶抑制剂,可逆转DNA的甲基化过程,诱导肿瘤细胞向正常细胞分化或诱导肿瘤细胞凋亡,并可诱导人骨髓间充质细胞向胰腺内分泌细胞分化。高浓度的5-AZA掺合可抑制DNA合成诱导细胞死亡,发挥其细胞毒作用。TSA是重要的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,即染色质重塑。我们的实验在5-AZA处理的基础上,对细胞的染色质重塑,WB细胞在这个阶段形态发生了改变,由多边形向梭形变化,同时我们检测了分化标志基因C/EBP,结果证明这两个小分子有促进细胞分化的作用。全反式维甲酸(RA)被证明在胰腺内分泌细胞发育早期起重要作用。在本实验中,RA联合转铁蛋白硒(ITS)诱导WB细胞获得WB-A细胞-胰腺内分泌前体细胞,同时表达PDXI、NGN3、NKX2.2、 Neurod、少量的in-sulin等基因。这个诱导方案为10天,即产生PDX1阳性的细胞,在以往的研究中大多采用转染PDX1这个基因获得产生胰岛素的细胞当然在近年来的一些研究中也有几种方法已被用于干细胞的分化,诱导表达PDX1阳性的细胞821,然而不管是这些诱导方案,还是本实验诱导方案,作用机制尚不清楚,是否通过某种信号通路,还有待进一步研究。
  本实验初步证实了,5-AZA、TSA和RA联合转铁蛋白硒(ITS)诱导WB细胞获得WB-A细胞为胰腺内分泌前体细胞,表达 PDXI NGN3 Neurod、少量的 insulin及 NEstin等基因,为不成熟的细胞,虽然有少量表达Insulin,但是无胰岛素的分泌,分化效率约为5%,还有待进一步的提高。在下一步的实验中将探索其在体内和体外进一步分化成熟的方法,继续探索小分子构建的微环境诱导方案在体外继续选择小分子化合物诱导这种WB来源的胰腺内分泌前体细胞细胞进一步分化为分泌胰岛素的细胞,并对其功能进行检测。
  接下来的研
究将把这种经过5-AZA、TSA和RA联合转铁蛋白硒(ITS)诱导WB细胞获得WB-A细胞-胰腺内分泌前体细胞,移植到糖尿病大鼠身上,观察能否降低糖尿病大鼠血糖,对移植细胞功能评估。本实验建立了一种简便且相对高效的体外诱导肝细胞到胰腺内分泌前体细胞的实验方法,为将来干细胞治疗糖尿病提供了充足的细胞来源。