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间充质干细胞培养使用说明书

细胞培养说明
<细胞培养>
1、准备
将间充质干细胞无血清生长添加剂MSCGs)2-8℃过夜融化,按1:20比例加入基础培养基中,即成为间充质干细胞完全培养基。
温馨提示:间充质干细胞完全培养基2-8℃避光条件下,可保存30天。若小里、多次使用建议您将间充质干细胞无血清生长添加剂MSCGS)分装后,保存于-20℃冰箱,可避免培养基不必要的浪费。
2、 间充质干细胞复苏(以T-75瓶为例)
①从冰箱中取出完全培养基,在生物安全柜或超净台中吸取适里(如T-75瓶:10-15m)完全培养基沿上表面加入间充质干细胞培养瓶中,切勿冲到细胞培养瓶底面,即:细胞生长面然后慢慢将细胞培养瓶平放,在37℃、恒温C02培养箱中放置5-10分钟后使用。
温馨提示:请严格按照此步骤操作,否则可能会出现细胞培养瓶中细胞生长空白区域,即所谓的“生长空洞”多数用户使用的不是专用的预包被细胞培养瓶,而是普通的细胞培养瓶或培养皿,其表面环境并不利于无血清培养环境下的间充质干细胞贴壁。37℃放置5-10分钟,可让培养基中的促贴壁物质更好地与细胞培养瓶底部结合,使得间充质干细胞的贴壁能力增强,降低“生长空洞”出现的概率。
②从液氮中取出冻存的间充质干细胞,迅速将冻存管放入37℃水浴中,快速融解。
温馨提示:尽可能避免水没过管帽,以减少污染的风险;要快速完成细胞复苏过程(尽量控制在1分钟内),融化过程时间过长,会造成复苏后细胞活性较差。
用70%-75%酒精消毒冻存管外壁,在生物安全柜或超净台中打开冻存管,用吸管/移液器将细胞冻存悬液缓慢移入装有5-10mL细胞完全培养基的15mL离心管中(在这一过程请尽可能避免产生气泡)
温馨提示:为了减少细胞损失,往细胞冻存管中加入1mL完全培养基,稍微吹打,用吸管/移液器将这1mL的细胞悬液吸入离心管中,再用吸管/移液器将离心管中的细胞轻轻吹打混匀。
④1200rpm离心5min,弃上清,加入2mL完全培养基重悬细胞,台盼蓝染色计数,按密度2×104ce11s/cm2将细胞接种至步骤①中孵育完的细胞培养瓶中,添加细胞时,将细胞培养瓶竖立,细胞悬液直接加到底部,切忌冲到细胞培养瓶底面。
⑤轻轻摇晃细胞培养器皿,使细胞均匀分布,混匀后,置于37℃、5%C02、饱和湿度的培养箱中静置培养。
⑥24h后,更换新鲜的完全培养基(温育至37℃)
3、间充质干细胞传代(以T-75瓶为例)
①在显微镜下观察细胞,当细胞融合度达到80-90%,即可传代。
温馨提示:细胞融合度请勿超过90%。很多传代后的细胞大比例死亡,是由于传代前细胞生长过密(融合度过高),导致细胞消化异常(细胞整片或成片脱落),加之随后的不当操作(如用移液器反复吹打成片细胞使其成为单个细胞),此机械损失过程会严重损害细胞膜,引发大比例的细胞死亡;间充质干细胞经冻存后再次使用时,尤为明显
②预处理细胞培养瓶,处理方法同细胞复苏中的步骤①。
②预处理细胞培养瓶,处理方法同细胞复苏中的步骤①。
在生物安全柜或超净台中,弃去细胞培养瓶中的培养液,加入5-10mL PBSA清洗细胞后弃去,再加入2mL0.05%胰酶-EDTA消化细胞
④在显微镜下观察到细胞变圆时,立即加入5mL胰酶抑制剂终止消化
⑤用移液器轻轻吹打瓶壁上还未完全脱离的细胞,并轻轻吹打混匀,使细胞完全分散。
⑥将细胞悬液转移至15mL离心管中,1200rp离心5min弃上清,加入2mL细胞完全培养基重悬细胞,台盼蓝染色计数,按细胞密度2×104ce11s/cm2,将细胞接种至细胞传代②步骤中孵育完的细胞培养瓶中,添加细胞时,将细胞培养瓶竖立,细胞悬液直接加到底部,切忌冲到细胞培养瓶底面
⑦轻轻摇晃细胞培养器皿,使细胞均匀分布,混匀后,置于37℃、5%C02、饱和湿度的培养箱中静置培养。
4、间充质干细胞冻存
①用0.05%胰酶-EDTA消化待冻存的细胞,加入胰酶抑制剂终止消化并离心,重悬后进行细胞计数
②1200rpm离心5min,弃上清。
根据细胞计数情况,缓慢加入适里冷的无血清冻存液(无血清冻存液可即拿即用或置于冰袋备用),调整细胞密度在1×106ce11s/mL左右。
④轻轻地重悬细胞,将重悬均匀的细胞按等份加入到灭菌的冻存管中(需提前做好标记),旋紧冻存管盖。
⑤迅速将冻存管放入程序降温盒中,然后将冻存盒直接放入-80℃冰箱
6过夜放置后,将细胞从-80℃冰箱转移至液氮罐中长期保存。

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