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微生物实验室菌种保藏方法

  菌种保藏
<菌种保藏>
  根据我实验室目前的条件可将原种制成若干液氮保藏管、- 80℃超低温冰箱保藏或 2 ~ 8℃ 斜面低温保藏菌种,同时可根据情况采取其他方式保藏作为工作用种子或标准储备菌株。检定菌应当有适当的标识,内容至少包括菌种名称、编号、代次、传代日期、传代操作人。
  菌种编号原则: 菌种简称 - 年、月、日 - 代次 - 序号,如 2013 年 7 月 20 日冻存金黄色葡萄球菌 F2 代 14 支,其中第 5 支标号为“金 - 130720 - F2 - 05”。菌种冻存管上应注明此编号,在装有菌种冻存管的盒子中应有标识注明菌种名称、代次、传代日期、传代操作人。
  a. 菌种简称: 采用菌种中文名称中第一个字。如大肠杆菌为“大”; 白色念珠菌为“白”; 金黄色葡萄球菌为“金”。
  b. 年号为 2 位数的年号( 如 13) 。
  c. 月号、日号为 2 位数。
  d. 序号从“01”开始。
1 、甘油冷冻管保藏法
  用无菌接种环轻轻刮取菌苔,并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水或培养基中,调整菌液浓度,制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为 30% 的无菌甘油,得到 15% 甘油菌悬液。注意甘油浓度不宜过高,否则会影响细菌细胞渗透压,引起细菌死亡。轻轻振摇小管,使内容物充分混合,分装于无菌小试管,制好的甘油冷冻管 - 20℃ 预冻后,放到降温盒置 -80℃超低温冰箱中保存( 至少在 - 30℃ 以下保存) ,从冷冻之日起一般可保存 2a,注意乙型溶血型链球菌需保存在血培养基冻存管超低温冰箱中,保存期限为 3 个月。
 2、 液体石蜡覆盖保藏法
  此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保藏时间在一年以上。取化学纯液体石蜡( 要求不含水分、不霉变) 100mL,装入 250mL 锥形瓶内加棉塞并包纸,在 121℃高压灭菌 30 min后 110 ~ 170℃烘箱 1 ~ 2 h 干燥去掉水分,再放入 40℃ 恒温箱中数天,以蒸发其中水分,至石蜡油完全透明为止,液层中无白色雾状物时即可,其目的是使灭菌时进入瓶内的水分得到蒸发。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上,28 ~ 30℃ 下培养 2 ~ 3d,证明无杂菌生长方可使用。将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中,在适宜条件下培养,然后,无菌操作,在层流台下用无菌吸管吸取无菌液体石蜡至培养好的菌种管内,石蜡注入量以高出培养基斜面 1cm,塞上橡皮塞,用固体石蜡封口,将试管直立,置于 2 ~ 8℃ 冰箱中或室温干燥处下保存。需要指出的是,有些菌种在室温下比在冰箱保存的时间还要长,如铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡。转管时直接用刀切取 1 小块菌种,移接到新的斜面培养基中央,适温培养,余下的菌种仍在原液体石蜡中贮藏。因经贮藏后的菌丝沾有石蜡,生长慢而弱,需再继代转接 1 次方可使用。贮藏场所应干燥,防止棉塞受潮发霉; 定期观察,凡斜面暴露出液面,应及时补加液体石蜡。也可用无菌橡皮塞代替棉塞或将棉塞外露部分用刀片切除,蘸取融化的固体石蜡封口,以减慢蒸发。
3、 斜面低温保藏法
  斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法,将菌种接种在适宜的试管或茄子瓶固体斜面培养基上,待菌生长充分以后,转移至 2 ~ 8℃ 冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有所不同,霉菌、放线菌及芽孢菌保存 2 ~ 4 个月,移种 1次; 酵母菌 2 个月移种 1 次,细菌每月移种 1 次。此法的缺点是菌种容易变异,在传代过程中,污染各种杂菌的机会也较多。因此,此法仅能用于工作用菌种的短期保藏,并应随时检查是否污染杂菌和变异等情况。
4、 液氮超低温保藏法
  液氮超低温保藏是把菌种装在含有冷冻保护剂的塑料保存管内,将该保存管预冻后放入液氮罐( - 196℃ ) 中进行保藏,由于菌丝体处于 - 196℃,远远低于其新陈代谢作用停止的温度( - 130℃ ) ,其代谢降低到完全停止的状态,所以不需定期移植,从理论上讲,菌丝体可以无限期地存活,是菌种保藏的最可靠最有效的方法,可达 20a 以上。该方法的冻存原则是慢冻速融。
 4. 1 制备菌悬液
  将需要保藏的菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,适温培养,当菌丝健壮地长满斜面时取出。配制 30% 的甘油溶液进行 121℃ 下高压灭菌 30min,将生长良好的斜面菌种用生理盐水制成菌悬液,菌浓度控制在 107 左右,然后加入等体积甘油水溶液混匀后制成 15% 的甘油菌悬液。
4. 2 分装菌悬液
  把购买的 1. 5 ml 的塑料冻存管拧松管帽置一烧杯中,外扎纱布、牛皮纸包扎好进行 121℃ 高压灭菌 30min。然后将制备好的菌悬液分装至 1. 5 mL 的塑料冻存管中,每支冻存管加入 1 mL 菌悬液,拧紧管帽,并用胶布封口,分别在胶布和冻存管上做好菌种标记。
4.3 液氮保藏
  先将菌液降温到 0℃,放到降温盒置 - 70℃ 冰柜中缓慢降温过夜,然后把装有菌液的冻存管放入液氮罐的气相中保存,在罐外做好标记以便取用所需的菌种。液氮中保藏的菌种复苏: 可将液氮保存的菌种管取出后立即放入 35 ~ 40℃的温水中迅速搅拌使之解冻,为了防止污染,用 75% 酒精擦拭冻存管管表面,表面干燥后,用无菌移液器把菌液移接至适宜培养基上进行培养。
  菌种工作中需注意的事项
( 1) 所有裸露菌的操作均应在生物安全柜中进行; 实验人员需注意加强自我保护意识,佩戴防护手套,穿着一次性反穿衣;
( 2) 工作结束后,要对操作台面及整个操作间进行紫外消毒; 所用到的接菌工具及剩余菌都须在灭菌柜中 121℃,30min 灭菌。总之,菌种复苏传代保藏工作是科研人员和微生物实验室人员应予以重视的工作,应建立一套完善的工作流程及标准化操作,以提高工作。

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