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微生物实验室菌种复苏流程

  菌种复苏
<菌种复苏>
  根据药典要求,新购进的脱水培养基都需进行培养基的灵敏度实验,合格后才能使用; 此外,无菌的半成品和成品在做无菌检查时还需要用金黄色葡萄球菌作为阳性对照; 再有,日常灌装环境监测时需冻存环境菌用于培养基灌装验证所需; 因此,微生物实验室需根据自己的实验需要冻存必要种类和数量的菌种。这样,就需要建立一个完整的菌种复苏传代保存的流程。
 
  首先,实验室使用的所有阳性菌标准品及实验室保存的环境菌都需建立一套完整的账目,即菌毒种应有严格的登记制度,建立详细的总账及分类账。收到菌毒种后应立即进行编号登记,详细记录菌毒种的学名、株名、历史、来源、特性、用途、批号、传代、冻干日期和数量。在保管过程中,凡传代、冻干及分发,记录均应清晰,可追溯,并定期核对库存数量。菌种复苏传代保存的流程概述如下:
 
1 用具与设备
  接种环,接种针,酒精灯,电热恒温培养箱,生化培养箱,冰箱,灭菌柜,超净台,液氮罐,超低温冰箱,1.5mL冻存管,试管等。
 
2 菌种的复活
  应在环境洁净度 10000 级下的局部洁净度 100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程必须严格遵守无菌操作,防止微生物污染,制备 F1,( 接收到合适菌种准备使用时,应根据菌种/细胞株的说明书制备复活的培养基对标准菌株、细胞株进行复活。清洁安瓿( 可用 75% 乙醇)后,用砂轮在安瓿的上部 1 /3 处划线,用干燥的无菌纱布包裹安瓿,将安瓿掰开。
  用一无菌吸管吸取 0. 5 ~ 0. 8mL 适量的液体培养基( 生孢梭菌用液体硫乙醇酸盐培养基; 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、短小芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌用营养肉汤培养基; 白色念珠菌、黑曲霉用液体改良马丁培养基) 滴加到安瓿中,轻轻旋转安瓿并吹打,使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解,再将安瓿内的菌液转移至相应的培养基中,根据菌种类型将其放入适宜的培养条件[细菌培养温度( 32. 5 ± 2. 5) ℃,18 ~ 24h; 真菌培养温度( 25. 5 ± 2. 5) ℃,3 ~ 5d]下培养,观察培养基是否浑浊,浑浊说明菌种复活生长,此为 F1,如不浑浊,细菌应延长培养时间至 7 天以上,真菌应延长培养时间至 14d 以上,仍不浑浊,按 121℃、30min 条件灭菌处理。复活后的菌株为标准储备菌株,应对复活后的标准储备菌株进行纯度和特性的确认。
  ( 1) 纯度确认: 指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。镜检观察菌落形态单一,没有其他杂菌存在,菌落特性符合。
  a. 菌落形态: 在特定的培养物上用无菌接种环将待测培养物稀释涂布或平板划线分离单个菌落,适宜条件培养后,观察同一平板上的单菌落大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似,是否具有典型的菌落形态。
  b. 镜检确认: 挑取上述单一纯菌落,对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性,染色特性符合要求; 细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
  ( 2) 特性确认: 生化试验或菌种鉴定系统应符合要求,具体参照现行版药典、API 菌种鉴定系统。

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